干货 常用细胞刺激方法汇总

飞蛾的趋光性，榕树根的向地性，草履虫的趋化性（避开高浓度盐水），本质都是生物体应激性的直接体现。

而作为生物体的基本结构单位和基本功能单位——细胞，对外界环境的刺激会更加敏感，会因此而产生各种生理反应，造成大量信号通路以及蛋白质水平变化。那么作为科研工作者，我们该如何科学而严谨的研究细胞对刺激的响应呢？
根据 SCI 文章 和 Proteintech 相关实验数据，我们汇总了包括凋亡、自噬、内质网应激、细胞周期、温度、氧含量、炎症、油酸刺激，共计 8 大类，20 余种常见的细胞刺激方法和检测方法 .
文章略长，干货略多，请慢慢享用~

1. 凋亡刺激
细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，能帮助多细胞生物去除不需要的或异常的细胞。它在生物体进化、内环境稳定以及多个系统发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。
在实验中，星孢菌素 (Staurosporine) 刺激和紫外线（UV）刺激是诱导细胞凋亡常用的两种方法。而 Caspase 蛋白家族则是细胞凋亡过程中关键的蛋白，为此可以 Caspase 蛋白的变化间接反应细胞凋亡的情况。

a) 星孢菌素刺激 Jurkat 细胞
实验方法：以 Jurkat 细胞为实验对象，待细胞密度达到 1.0X106 个 /mL 时，加入星孢菌素终浓度 1μM，刺激时间 6h，按时间梯度取样，以 Caspase 3 抗体（Cat No. 19677-1-AP，Proteintech）检测 Caspase 3 蛋白水平的变化。
实验结果：星孢菌素刺激之后，随着刺激时间加长，全长 Caspase 3 的蛋白水平不断下降；剪切体 Caspase 3 的蛋白含量不断增加，间接反映了细胞凋亡的发生和加强。

b) 紫外线刺激 HeLa 细胞
实验方法：以 HeLa 细胞和为实验对象，待细胞汇合度达到 90% 时，使用超净工作台紫外灯刺激细胞，刺激时间 2h，对照组正常光照培养；以 Caspase 12 抗体（Cat No. 55238-1-AP，Proteintech）检测 Caspase 12 蛋白水平的变化。
实验结果：UV 刺激之后，全长 Caspase 12 和其剪切体蛋白水平显著上升，间接反映了细胞凋亡的发生和加强。

2. 自噬刺激
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程。细胞借此实现自身的代谢需要和某些细胞器的更新。饥饿胁迫和雷帕霉素（Rapamycin）处理等可引起自噬（增强自噬小体形成）；氯喹或巴弗洛霉素 A1 等溶酶体抑制剂可以抑制自噬（抑制自噬小体和溶酶体结合）。LC3 蛋白，尤其是脂化后的 LC3-Ⅱ是自噬小体膜组分，可用于自噬小体标记，同时脂化后的 LC3-Ⅱ和未脂化的 LC3-Ⅰ二者含量的变化也可体现细胞自噬的水平。

a) 无血清培养 HepG2 和 HEK293 细胞
无血清培养所造成的营养缺失可诱导细胞出现自噬，形成自噬小体。低浓度氯喹可以改变溶酶体的 pH 值，阻止自噬小体和溶酶体的结合，从而使自噬小体处于可观察状态。
实验方法：实验组 HEK293 和 HepG2 无血清培养 2 h 后换新鲜培养基，加入终浓度为 50 μM 的氯喹培养 24 h； 对照组 HEK293 和 HepG2 无血清培养 2 h 后换新鲜培养基，24 h 后同实验组一起收细胞。刺激完成后以 LC3 抗体（Cat No. 14600-1-AP，Proteintech）通过免疫荧光（IF）实验直接观测自噬小体的数目或 WB 实验检测 LC3-Ⅱ 和 LC3-Ⅰ 的蛋白水平。
实验结果：IF 实验显示氯喹处理的细胞中 LC3 蛋白由未处理时的均匀而弥散分布 转变成 聚集的环形和点状亮斑结构（自噬小体）；同时 WB 实验显示氯喹处理后细胞脂化的 LC3-Ⅱ含量升高；两个实验均表明处理之后自噬水平大大提高。

b) 雷帕霉素刺激 293T 细胞
雷帕霉素作为经典的自噬诱导剂可通过抑制 mTOR 信号通路进而增强自噬的发生。
实验方法：刺激 24 h 铺细胞，在细胞汇合度 70%-90% 开始刺激，加入终浓度分别为为 20 nM、100 nM、500 nM 的雷帕霉素刺激 293T ，同时还可设置时间梯度 0h，6h，18h，24h；另设对照实验，即可同上实验，以 LC3 蛋白通过 IF 或者 WB 监测细胞自噬的发生和变化。

c) 羰基氰-化物间氯-苯腙（CCCP）增强线粒体自噬
羰基氰-化物间氯-苯腙（CCCP）作为一种氧化磷酸化解偶联剂能抑制线粒体电子传递链，影响线粒体蛋白合成。CCCP 可以促进 PINK1 蛋白的表达，PINK1 蛋白进一步刺激泛素分子的 65 位丝氨酸磷酸化，募集并激活 parkin，进而诱导线粒体自噬。
实验方法：刺激 24 h 铺细胞，细胞汇合度 70%-90% 开始刺激，使用终浓度为 10 μM CCCP 刺激 24 h，设置好对照 (CCCP 以 DMSO 稀释，母液浓度 10mM) 。以 Phospho-Ubiquitin(Ser65) 抗体（Cat No. 28375-1-AP, Proteintech）WB 实验检测 65 位丝氨酸磷酸化的泛素分子的蛋白水平。
实验结果：CCCP 刺激之后，泛素的 65 位丝氨酸磷酸化水平显著上升，表明线粒体自噬水平增强。

3. 内质网应激刺激
内质网应激（ER stress）表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱，可激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和 caspase-12 介导的凋亡通路等，既能诱导糖调节蛋白 GRP78、GRP94 等内质网分子伴侣表达而产生保护效应 ，亦能独立地诱导细胞凋亡。在内质网应激发生时，相关蛋白 ATF4 和 CHOP 的表达水平会发生显著变化，故可用于内置网应激检测靶标。

a）衣霉素刺激 PC-3 细胞
实验方法：衣霉素是诱导内质网应激发生的主要刺激物。实验 24h 铺细胞，细胞汇合度 70%-90% 开始加入衣霉素刺激，刺激浓度分别为 2 μg/ml， 4 μg/ml，刺激时间 24 h，对照组加入等体积 DMSO。以 CHOP 抗体（Cat No. 15204-1-AP，Proteintech）WB 实验检测 CHOP 蛋白的表达水平。
实验结果：随着衣霉素浓度升高，CHOP 蛋白的表达水平也越高，表明细胞的内置网应激水平也在提升。

b）毒胡萝卜素刺激 HepG2 细胞
实验方法：毒胡萝卜素（Thapsigargin）同样可以有效诱导内质网应激发生。实验 24 h 铺细胞，细胞汇合度 70%-90% 时开始刺激，使用终浓度为 1 μM Thapsigargin 刺激 24 h，设置好对照（Thapsigargin 以 DMSO 稀释，母液浓度 1mM），以 ELISA 试剂盒（Human ATF4 ELISA Kit，Cat No. KE00147，Proteintech）检测内质网应激相关蛋白 ATF4 的表达水平变化。
实验结果：ELISA 实验结果显示，毒胡萝卜素刺激后，ATF4 的蛋白水平有显著的提升，表明内质网应激正在发生中。

4. 细胞周期
G0 期，G1 期，S 期，G2 期和 M 期等是细胞周期的 5 个阶段，调控着细胞的生长、分裂。细胞周期的调控刺激，掌控着细胞的命运。

A）Nocodazole 刺激 HeLa 细胞
实验方法：Nocodazole 是常用的细胞中期阻断剂，可以将细胞周期阻断在 M 期，使得细胞周期同步。实验时加入终浓度为 1 μg/ml Nocodazole 到汇合度为 70% 左右的 HeLa 细胞，分别培养 48 h、24 h、16 h 后收细胞，对照组不刺激。

B）BrdU 刺激 HeLa 细胞
溴脱氧尿苷（BrdU）是一种合成核苷，类似于胸腺嘧啶。它可以被合并到新合成的复制细胞的 DNA(在 S 期，DNA 复制过程中取代胸苷）。因此，BrdU 被用于测定出生日期和监测细胞增殖。
实验方法：在 HeLa 细胞中加入工作浓度为 0.03 mg/ml 的 BrdU，37℃培养 2 h，后收细胞固定，2 M HCl 处理 30 min，对照组不刺激。通过 IF 实验以 BrdU 抗体（Cat No. 66241-1-AP，Proteintech）检测 BrdU 的插入情况。
实验结果：BrdU 聚集在细胞核中，标记正在增殖的细胞。

C）CaCl2 刺激 EC109 细胞
实验方法：刺激 24h 铺细胞，刺激时细胞汇合度 70%-90%，加入终浓度为 0.06 mM 及 1.8 mM CaCl2 培养基分别培养 0 d、3 d、5 d、7 d、10 d 收细胞，随后通过 WB 实验和 IF 实验检测 ZNF750。

D）胰岛素刺激 HeLa 细胞
实验方法：胰岛素可通过 mTOR 信号通路调控细胞周期和细胞增殖。故以胰岛素刺激细胞同样会引起细胞周期的相关变化。刺激 24h 铺细胞，刺激时细胞汇合度 70%-90%，加入终浓度为 100nM 胰岛素刺激 15min 后收细胞，设置无刺激对照。

5. 温度刺激
鸟类和哺乳动物由于体温调节机制比较完善，能够在环境温度变化的情况下保持体温稳定，被称之为恒温动物。在受到低温环境刺激时，为维持体温恒定，生物体会通过各种通路调控细胞代谢，部分蛋白水平会发生明显改变。典型的就是 CIRBP（cold inducible RNA binding protein），为此以 CIRBP 作为低温响应检测指标。
低温刺激
实验方法：以 HepG2 细胞为实验材料。取相同培养条件的细胞和相同数量的细胞，在 4℃（低温）、25℃（室温）、37℃（体温）条件下培养 1 小时，随后收集细胞，制备裂解液，以 CIRBP 抗体（Cat No. 10209-1-AP，Proteintech）通过 WB 检测 CIRBP 的蛋白水平。
实验结果：随着温度降低，CIRBP 蛋白的表达量越高，表明细胞对低温的响应越强烈。

6. 氧含量刺激
 氧气是维持细胞和生物体活动所需能量来源的重要物质基础，也是机体新陈代谢启动机制的关键。低氧环境可以增强呼吸强度，抑制生理运作；过氧化环境则会促进衰老。
a) 低氧刺激
实验方法：CoCl2 是一种化学性低氧模拟剂，在多种培养细胞中能模拟低氧状况。实验 24 h 铺细胞，待细胞汇合度 70%-90% 时开始刺激。使用终浓度为 250 μM、400 μM 的 CoCl2 溶液分别刺激 6 h，对照组不加 CoCl2 。HIF1a 是细胞对缺氧反应的主要调节因子，在缺氧条件下蛋白水平会显著变化，并且亚细胞定位也会改变，可作为低氧刺激检测指标。
实验结果：在 CoCl2 处理之下，以 HIF1a 抗体（Cat No. 20960-1-AP，Proteintech）检测 HIF1a，结果表明 HIF1a 的蛋白水平显著上升，同时亚细胞定位由胞质向核内转移，表明细胞对低氧刺激有明显响应。

b）过氧刺激
实验方法：以 HeLa 细胞和 HEK293 细胞为实验对象；使用利尿酸（ethacrynic acid，EA）刺激细胞产生胁迫。刺激 24h 铺细胞，细胞汇合度到 70%-90% 开始刺激，加入终浓度为 100 μM EA 刺激 5 h 后收样，设置无刺激对照。TDP43 蛋白的磷酸化是很多神经退行性疾病的一个指标，同时它也是细胞响应过氧应激的一个重要角色。
实验结果：EA 刺激之后，以 TDP-43 抗体（Cat No. 22309-1-AP，Proteintech）检测 TDP43 ，结果显示 TDP-43 蛋白被磷酸化（50 kDa），并被剪切成 TDP35 的磷酸化片段（35 kDa），表明细胞正在响应 EA 给细胞造成的刺激。

7. 炎症刺激
炎症是机体对于刺激的一种防御反应。细菌、病毒、真菌、寄生虫等生物因子，酸、碱、坏死组织的分解产物等化学性因子，高温、低温、放射线物质、紫外线和机械损伤等物理因子都可以导致炎症反应。
在实验中，我们常以下面几种化合物或者化合物组合来刺激细胞建立炎症模型。在炎症发生之后，细胞中的 PD-L1 蛋白和 IDO1 蛋白的水平会发生明显变化，二者可作为炎症检测靶标。

a）PMA 刺激 Jurkat  细胞
实验方法：Jurkat 细胞密度 1.0 x 106 个 /mL，实验组加入终浓度为 10 ng/ml PMA 培养 2 h（PMA 母液以 DMSO 配制），对照组加入等体积 DMSO，2 h 后收细胞制备裂解液。

b）LPS 刺激 HepG2 / U937 / THP-1 细胞
实验方法：刺激 24 h 铺细胞，刺激时细胞汇合度 70%-90%，实验组使用终浓度为 0.1 μg/ml LPS 刺激 18-24 h，设置无刺激对照。

c）TNF-α 刺激 HUVEC 细胞
实验方法：刺激 24 h 铺细胞，刺激时细胞汇合度 70%-90%，实验组使用终浓度为 10 ng/ml 刺激 18 h，设置无刺激对照。

d）PHA+LPS 共刺激
实验方法：细胞密度 0.5x106 个 /ml，6 孔板每孔细胞总量 1 x 106 个，PHA 终浓度 10 μg/ml ，LPS 终浓度 50 ng/ml ；刺激时间分别为：PHA 30min+LPS 10min；PHA 1h  +LPS 30min； PHA 1d + LPS 2h；PHA 2d  +LPS 1d；PHA 3d  +LPS 2d。

e）CD3 单抗刺激 Jurkat 细胞（T 细胞活化）
实验方法：刺激时 Jurkat 密度 1.0 x 106 个 /ml，实验组加入 CD3 单抗浓度 15 μg/ml，刺激 6 h 后收细胞，设置无刺激对照。

f）IFN-gamma 刺激 A375 / A549 / HeLa 细胞
实验方法：刺激时细胞密度 1.0 x 106 个 /ml，IFN-gamma（Cat No. HZ-1301，Proteintech）浓度 15 μg/ml，刺激 48h 后收细胞，设置无刺激对照。通过 PD-L1 抗体（Cat No. 66248-1-AP，Proteintech）和 IDO1 抗体（Cat No. 13268-1-AP，Proteintech）检测二者蛋白水平变化。
实验结果：以 IFN-gamma 刺激 A375 / A549 / HeLa 细胞为例，在刺激之后，细胞中的 PD-L1 和 IDO1 的蛋白水平显著上升，表明细胞正在发生炎症反应。

8. 油酸刺激
脂滴是细胞内中性脂的储存的主要场所，是脂代谢的研究材料。用油酸（Oleic acid）刺激细胞可以诱导脂滴的形成。ADRP/Perilipin 2 是脂滴的标志物。通过 IF 实验利用 ADRP 抗体可以很好地展示细胞中的脂滴。

油酸刺激
实验方法：实验 24 h 铺细胞，细胞汇合度 70%-90% 开始刺激，使用终浓度为 600 μM 的油酸刺激 19 h，设置对照。以 ADRP 抗体（Cat No.15294-1-AP，Proteintech）检测该蛋白的亚细胞定位。
实验结果：油酸刺激之后，细胞胞质中出现大量圆环状的结构，表明在油酸刺激下，细胞中的脂滴数量有显著上升。

以上就是想和大家分享的全部内容啦~
八大类，20 余种细胞刺激方法！
老师再也不用担心我的实验咯~

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