| 内皮细胞分布于整个循环系统，从心脏到*小的毛细血管。在这个步骤中，气管的活力很非常重要。取出器官和开始消化之间的时间越短将提高细胞更有活力的产出及不在含氧量低的条件下太久。小鼠的数量需要：小鼠应该是5~6周大小。年龄大的小鼠内皮细胞的产出会少些。*少5个小鼠可以得到很好的产出。 一、材料和试剂 1. 内皮细胞生长添加剂（ECGS）（Sigma，catalognumber：E2759） 2. 胶原酶I（Invitrogen，Catalognumber：17100-017） 3. BSA 4. DMEM 5. FCS 6. Antibiotic 7. Heparin 8. F12medium 9. Isoflourane 10. Ethonol 11. Dynabeads 12. anti-CD31antibody（BDPharmingen，catalognumber：550274） 13. M199 14. gelatin 二、设备 2. 无菌培养橱 3. 磁铁 三、步骤 1. 取小鼠的肺 （1）麻醉小鼠直到小鼠半睡。我们通常用吸入的麻醉剂例如异氟醚。 （2）用70%乙醇消毒小鼠的皮肤和手术器械。横切小鼠，低但平行于膈，然后穿过肋骨切开暴露胸腔，迅速切除肺，放到冰上预冷的DMEM。一旦所有的肺都取好后，移到无菌培养橱进行下面的步骤。 （3）切碎肺组织，清洗几次去除血液，用3 ml 消化液37°C培养45分钟（3×15 min withpipettingbetween）离心。 （4）将肺组织切的更细（到大约1 mm 的碎片）并放到5 ml 消化液中37度消化。用手不断晃动混合物，每五分钟换一次消化混合物。为了这样做，离下碎片，去除上清，用5 ml 预热的消化溶液代替培养基并继续混合。 （5）加入1/10体积的血清到消化溶液中。这将失活酶并让细胞附着。将细胞放到组织培养塑料上1小时。这个预铺让成纤维细胞附着而不是内皮细胞（EC）。 （6）去除未附着的细胞，离心200×g 5 min，然后直接进入富集步骤。 2. 富集内皮细胞 用抗体包被免疫磁珠分离内皮细胞：加入25 ul 免疫磁珠（1x107）到一个1.5 ml 离心管中，用1 ml PBS洗磁珠两次，加入100 μg anti-CD31抗体到100 μl PBS到免疫磁珠并4°C慢摇24小时。用磁铁收集anti-CD31包被的磁珠。当管在磁铁里时去除上清，4°C用PBS洗磁珠洗3次，一次10分钟，*终4°C过夜。用磁铁收集磁珠，去除上清。4°C，用500 μl PBS/0.1%BSA重悬，使到达一个2×107beads/ml 的终浓度。 3. 用磁珠分离内皮细胞 （1）在离心细胞后（200×g，5 min），加入15%FBS+M199。37°C，用15%FBS+M199洗细胞3次，200×g，5 min 沉淀细胞。 （2）在1-2%FBS+M199重悬，使终浓度为10-40×106cells/ml。 （3）按1：10比例磁珠加入到内皮细胞中（内皮细胞大约为总细胞的0.02%） （4）4°C旋转珠沉淀物30分钟。将管放到磁铁上2-3分钟，去除上清，用2 ml M199重悬磁珠。重复4次。 （5）为了从anti-CD31抗体包被的磁珠中释放细胞，加入含5 mM EDTAPBS并37°C旋转10分钟。 （6）洗完四次后，将珠放到培养培养基中。对于培养鼠的内皮细胞，在铺细胞前，预先用0.2%明胶包被平板。 原创作者：上海雅吉生物科技有限公司 |
