联系我们
- 公司名称：上海雅吉生物科技有限公司
- 电话：021-34661275
- 传真：021-34661275
- 联系人：杨浩
- 手机:15316083058
|
技术文章详细
哺乳动物细胞总RNA的分离 |
| 阅读次数：4285 发布时间：2022/7/6 9:06:28 |
一、细胞的裂解
单层细胞的裂解
悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解
a．单层细胞的裂解
a）吸出培养液，以7ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液PBS冲洗细胞培养皿内的单层细胞，重复1次，将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上，再将铝板置于冰盘上。
b）直径为90mm的培养皿需加0.5ml RNA提取缓冲液， 并使之遍布整个平板的表面。
RNA提取缓冲注液
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl2
10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)
0.5％NP-40
1mmol/L二硫苏糖醇（DTT）
100单位/ml胎盘RNA酶抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物
c）加0.5ml蛋白酶消化缓冲液，用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。
蛋白酶消化缓冲液
0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
25mmol/L EDTA(pH8.0)
0.3mol/L NaCl
2％ SDS
d）用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。
c）加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟。
蛋白酶K以贮存液的形式保存，贮存液为20mg/ml 蛋白K溶液。
b．悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解
a）于4℃以2000g离心5分钟收集细胞，以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀，洗涤细胞3次，每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀，使其底分散。
b）估计细胞沉淀的体积，用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。
c）加入与步骤b）所加RNA提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液，用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。
d）加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟。蛋白酶K以贮存的形式保存，贮存液为20μg/ml蛋白酶K水溶液。原创作者：上海雅吉生物科技有限公司 |
|
