在体外联合使用CD3和CD28的抗体刺激T细胞，模拟T细胞活化的双信号作用，是进行T细胞激活与扩增应用广泛的方法。除直接使用功能学抗体以外，目磁珠法（CD3/CD28抗体偶联磁珠）以及多聚体法（CD3/CD28抗体偶联Streptamer多聚体）也是激活扩增T细胞比较常见的两种方法。以上说到的无论是抗体法、磁珠法、亦或者是多聚体法，归根结底都是借助于CD3与CD28抗体对T细胞进行刺激。
下面，我们以小鼠脾脏样本为例，分享分别利用CD3与CD28的功能学抗体，以及CD3/CD28 Streptamer®激活扩增T细胞的实验步骤与实验结果。
CD3/CD28抗体法
实验步骤：
1. 抗体包被
用无菌PBS将anti-mouse CD3抗体（克隆号：145-2C11）稀释至5μg/ml，稀释后的抗体加入到24孔板中，每孔400μl，4°C包被过夜。（注：板子在加入抗体之，先用无菌PBS润洗2-3遍，避免干孔）；
2. 小鼠脾脏淋巴细胞分离（次日）
（1）将70μm细胞筛网置于培养皿中，取小鼠脾脏放置于筛网中，加入5ml达优小鼠淋巴细胞分离液，对脾脏轻轻进行研磨（注：此步操作要快，避免分离液蒸发）；
（2）把悬有脾脏细胞的的分离液立即转移至15ml离心管中，随后在分离液上层轻轻覆盖500-1000μl的RPMI1640培养基（保持分离液与培养基分界明显）；
（3）室温，水平转子800g离心30分钟，设置离心机为缓升缓降；
（4）离心结束后吸出淋巴细胞层（白膜层），加入10ml RPMI1640洗涤一遍细胞，250g离心10分钟收集细胞；
（5）将上一步离心得到的细胞沉淀，重悬至扩增培养基中，并进行计数。
3. 细胞刺激（次日）
扩增培养基成分：RPMI1640 + 10% 血清 + 5ug/ml anti-mouse CD28（clone：37.51） + 双抗
（1）将细胞浓度调整至1-2×10^6/ml（本次实验为2×10^6/ml，该浓度偏大）；
（2）从4°C冰箱取出一天包被的板子，弃掉包被液，无菌PBS洗涤3遍；
（3）每孔加入500μl细胞悬液，放置于37°C含5% CO2细胞培养箱中培养。
实验结果
图：1×10^6/孔细胞，5μg anti-mouse CD3与CD28刺激3天后细胞形成明显克隆团
CD3/CD28 Streptamer®多聚体法
实验原理
使用低亲和力的抗CD3和抗CD28的抗体Fab片段（非传统全长抗体），结合上Twin-Strep-tag亲和标签，形成CD3 Fab-Strep和CD28 Fab-Strep。再结合可溶性蛋白多聚体Strep-Tactin®，在亲和力作用下，即可与TCR和CD28共刺激受体多价结合，来传递激活信号。该方法大的优势是在刺激过程中，能够通过加入biotin移除刺激试剂，达到精确掌控活化时间的目的。
实验步骤
小鼠脾脏淋巴细胞的分离与上面抗体法中步骤相同，当然，也可以选择用分选试剂盒进一步分选得到T淋巴细胞进行刺激。（注：如果选择提富集T淋巴细胞，建议使用阴选试剂盒或可以去除分选试剂的阳选试剂盒）
（1）将CD3 Fab-Strep、CD28 Fab-Strep、Strep-Tactin® Multimer按照1:1:1的比例进行混合，4°C孵育20分钟，期间进行连续搅拌，如果是在静置条件下孵育中间进行几次吹打混匀，该孵育时间可适当延长。孵育结束制备得到CD3/CD28 Streptamer®混合物；
（2）用培养基（成分：RPMI1640 + 10% 血清 + 50U/ml IL-2 ）调整细胞浓度至5×10^5/ml，将步骤（1）中制备好的CD3/CD28 Streptamer® complexes与细胞悬液进行混合，轻轻吹匀后，将细胞加入到细胞培养板中，放置于37°C含5% CO2细胞培养箱中培养。细胞数量、培养基体积、多聚体用量配比参考以下表格：
（3）培养过程中，每天观察细胞的状态，是否形成克隆团，或进行细胞计数，如果出现培养基变黄或细胞密度过高的情况，吹散细胞克隆团后调整细胞密度至0.5-1×10^6/ml，更换培养板和培养基；
（4）移除CD3/CD28 Streptamers终止刺激（该步根据实验需求可选做）：直接向刺激后的细胞悬液中加入终浓度为1mM的Biotin，室温孵育30分钟。收集并转移细胞至15ml离心管中，加入10ml培养基，300g离心6-10分钟，弃上清，再次加入10ml培养基重复一遍洗涤步骤，至此，细胞已经可以用于下游分析。
实验结果
以下实验结果是分选得到T淋巴细胞后进行的刺激，在此特别感谢德国IBA Lifesciences提供的内部实验数据以及详细实验步骤。
图：小鼠脾脏T淋巴细胞扩增至3天时，显微镜下观察细胞克隆团的形成
图：小鼠脾脏T淋巴细胞扩增过程中，通过流式细胞术实时检测T细胞激活marker CD25、CD69的表达情况
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